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无缝克隆-让载体构建如此简单(文末有福利)

2020-09-28 1445

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    基因克隆或分子克隆,是应用酶学方法在体外将不同来源的DNA分子重新组装成杂合分子,并使之在适当的宿主细胞中进行扩增,形成大量子代DNA分子的过程。


    基因克隆方法经过几十年的发展,从传统的DNA连接酶介导的平粘末端克隆及TA克隆技术,到基于拓扑异构酶的TOPO克隆技术,再到基于DNA重组酶的Gateway重组和无缝克隆技术。相比之下,无缝克隆操作更加简单,灵活性更强,同时几乎不受序列的限制,一次可定向组装多个片段的dsDNA。

【文末有福利哟~】


一、无缝克隆的原理

    与传统的双酶切克隆类似,无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对,并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口。但是,无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端,而是通过“外切酶”T5核酸外切酶来产生的,它能沿着5’→3’方向,降解dsDNA,从而产生黏性末端。我们可以通过PCR的方法,在外源拼接片段的两端加上线性化载体的序列,在T5外切酶作用下,就能产生几乎一致的黏性末端。相同的黏性末端互补配对之后,借助DNA聚合酶进行修复添加缺失的碱基。最后一步借助Taq DNA连接酶,催化形成磷酸二酯键,将所有缺口补齐。

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二、无缝克隆的优势

1.不受片段序列的限制、实现任意组装。

传统的酶切克隆,会受到酶切位点的限制。而无缝克隆不依赖于限制性内切酶,仅需通过引物制作同源臂,只要一个试剂盒就可解决所有克隆实验。


2.同时无缝地拼接多个片段。

传统的酶切克隆,由于酶切位点限制,能组装的片段数量有限且在片段与片段之间产生“缝隙”。多片段拼接操作复杂,效率也较低。而无缝克隆可通过一步反应轻松拼接4-5个片段,可达10个。


3.节省时间,操作简便。

传统的酶切克隆,首先需要进行PCR,胶回收,然后酶切载体和外源片段,再纯化、连接、转化。如果需要进行多片段组装,还要花费更多时间。而无缝克隆仅需PCR和纯化或胶回收,随后即可直接进行一步多片段拼接。

三、无缝克隆实验流程及设计方法

    麦伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit 产品在30分钟内可以将一个或多个PCR扩增片段(平端)克隆插入任意载体的任意位置,室温孵育即可完成片段的连接,高效,准确,克隆阳性率可达95%以上。实验流程如下图:

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引物设计原则:通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列,使扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列 (15 bp~25 bp)。

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四、麦伯应用实例

1. 使用麦伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit进行单片段及多片段重组产物转化后,平板上均可产生较多单克隆,无插入片段的阴性对照版上几乎无克隆产生。



2. 单片段转化板挑取20个单克隆进行菌落PCR,克隆阳性率达95%以上。

3.  4片段重组转化板挑取15个单克隆进行菌落PCR,克隆阳性率达85%以上。

                      

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