核酸是一种生物分子,包括DNA和RNA,是生命体内储存和传递遗传信息的基本分子。DNA主要集中在细胞核、线粒体和叶绿体中,而RNA则主要分布在细胞质中。核酸提取是指从复杂体系中实现核酸的分离和纯化,以便进行相应的科学研究和实际应用。
1、保证核酸一级结构的完整性;
2、排除其它核酸分子的污染(如提取DNA时排除RNA的干扰);
3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;
4、尽可能降低其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。
1、裂解细胞,释放核酸:使用裂解液破坏样品细胞结构,从而使样品中的核酸游离在体系中;
2、核酸的分离与纯化:将与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除;
3、核酸富集与洗脱:采用洗脱液处理吸附有核酸的吸附物,富集得到目的核酸。
1、溶液法
是比较经典的提取方法,苯酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,变性降解核蛋白,使DNA从核蛋白中游离出来。而DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏,变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存在于上层水相中,蛋白质则沉淀于两相之间。离心分层后取水层,经过多次重复操作,并合并含核酸的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇/异丙醇来沉淀核酸,然后再进行分离和纯化、溶解后即可得到高纯度核酸。
溶液法成本低,但存在有毒试剂,影响操作人员健康,而且较为繁琐,操作时间长,提取的核酸质量也较为一般。
2、柱提法
利用特殊硅基质吸附材料,能够特定吸附核酸,而蛋白质、多糖、脂类等基本不吸附,被离心沉淀与核酸分离的原理。硅胶膜表面存在的硅醇基团呈弱酸性,水化后带负电。样品裂解后,如果溶液中存在一定浓度的阳离子时,会中和DNA硅醇基团之间的表面负电荷,从而使DNA能够牢固地吸附在硅胶膜表面。而当处于低盐水溶液时,DNA磷酸基团和硅胶膜的硅醇基团之间存在排斥,硅胶膜就会把DNA释放出来,从而达到分离纯化核酸的目的。
柱提法试剂盒价格较低,操作相对简单,在市面上应用较为广泛。但是其对样本起始量会有一定的限制,当投入样本过多(如大块组织)可能导致吸附膜堵塞,同时由于需要反复离心不便于高通量、自动化操作等。
3、磁珠法
与硅基离心柱原理类似,磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸特异性结合和解离,先使用细胞裂解液裂解细胞,核酸带负电的磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与磁珠表面羧基形成离子桥,使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面,利用磁珠的磁性,可通过外加磁场进行收集洗脱,获得质量较好的核酸模板。
磁珠法不需要离心、无需加入多种试剂,操作简单,符合核酸自动化提取要求,但是成本较高。
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶,具有很高的比活性。蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质,分离DNA与蛋白质,使DNA能够更好被提取。还可降解RNA水解酶(RNase)活性,抑制RNase水解模板的RNA,在RNA的提取和检测过程中起到不可或缺的作用。而RNA极不稳定、易于被广泛存在的RNase降解,因此利用蛋白酶创造一个无RNase的环境、严格防止RNase污染是成功提取RNA的关键。
1、PCR扩增:从提取的DNA或RNA中扩增目的片段,用于分子诊断、分子生物学研究、药物研发、病毒检测等。
2、实时荧光定量PCR:用于定量检测DNA或RNA的含量,可以用于基因型检测、差异表达分析、细胞数量、病毒载量、转基因生物检测等。
3、基因测序:对提取的DNA或RNA进行测序,用于肿瘤基因组学、新生儿筛查、精准医学和基因诊断等。
4、蛋白质研究:用提取的DNA或RNA表达翻译合成蛋白质,用于研究蛋白质结构、功能等。
这些下游应用可以帮助我们更深入地研究生物样本中的DNA或RNA,并揭示它们在生物学、医学等领域中的重要作用。