本期，我们继续聊聊数字PCR在肿瘤液体活检中的应用，上期内容：

基因突变检测与治疗反应监测

癌症相关基因突变随疾病进展或治疗的进展而动态变化，因此基因突变的检测可以用来监测癌症的转移或复发。

例如，KRAS基因突变在结直肠癌和胰腺癌中均有较高的发现率，被认为与肿瘤的发生、复发及患者预后直接相关。现有的检测KRAS突变的方法有Sanger测序、二代测序、ARMS-PCR等，Sanger测序的突变检测限约为20%；二代测序方法的突变检测限约为5%；ARMS-PCR方法的突变检测限在1%左右，而dPCR用于突变检测的突变检测限可以达到0.05%~0.10%，甚至更高（表1）。

表1不同方法学KRAS基因突变检测限

文献案例1：

数字PCR检测结直肠癌患者血浆中 KRAS突变，可作无创生物标志物

KRAS 突变是导致结直肠癌患者对抗表皮生长因子受体治疗产生耐药性的原因。通过数字PCR检测血浆cfDNA中的 KRAS 突变（“液体活检”）已成为一种非常灵敏且有潜力的连续活检疾病监测的替代方案。

在这项研究中，通过ddPCR分析了10名结直肠癌患者血浆DNA中的 KRAS G12V突变，并与6名健康供体进行了比较。

结果显示，结直肠癌患者KRAS 突变为35.62copies/mL（中位数），而在健康对照中仅发现残留拷贝（0.62copies/mL，p =0.0066）。转移性疾病患者的血浆KRAS G12V突变拷贝数明显高于M0患者（中位数分别为126.25copies/mL和9.37copies/mL，p =0.0286）。

与健康对照比较，结直肠癌患者血浆中野生型KRAS和KRASG12V突变的拷贝数显著升高。此外，在癌症转移的情况下，突变拷贝数会更高，说明KRASG12V突变与预后相关，如进展差、术后并发症发生率高、生存期短等。因此该突变可作为监测结直肠癌疾病进展的无创生物标志物之一，利用ddPCR检测结直肠患者血浆中KRASG12V突变是可取的。

文献案例2：

使用数字PCR检测乳腺癌和胃癌患者的HER2扩增

人表皮生长因子受体-2基因（HER2，ERBB2）编码HER2蛋白，该HER2蛋白在正常组织中罕见表达灶，但是HER2异常扩增会导致HER2蛋白在乳腺癌、胃癌和其他肿瘤细胞中过度表达，其表达水平与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。

目前，HER2基因表达检测被广泛用作乳腺癌和胃癌患者靶向治疗的辅助诊断工具，批准用于临床的检测通常是基于蛋白质水平的免疫组织化学或基因水平的荧光原位杂交，但这些检测只能用于组织标本，无法对肿瘤细胞的HER2进行动态监测。

为了评估该测定与目前临床使用的测试的总体一致性，招募了206患者，并对每个样本的FFPE组织切片进行了FISH、IHC和血液样本数字PCR检测。

在206例乳腺癌患者中，68例（33.01%）经dPCR鉴定为HER2阳性。对51个IHC2+样本进行FISH检测，以确认HER2基因是否发生突变。FISH结果显示11例（21.57%）为阳性，其余40例（78.43%）为阴性。乳腺癌FFPE组织样本中dPCR和IHC/FISH的一致性为96.1%（206例中有198例），敏感性为92.65%（68例中有63例），特异性为97.83%（138例中有135例）（如下表）。

对91例胃腺癌患者进行了dPCR和IHC/FISH检测。结果显示，21例（23.08%）被dPCR认定为HER2阳性，70例（76.92%）为HER2阴性。IHC确定了19例阳性（20.88%）和60例阴性（65.93%）。其余12例IHC2+胃癌样本的FISH检测显示2例阳性（17%）和10例阴性（83%）。胃癌FFPE组织样本中dPCR和IHC/FISH的一致性为95.6%（87/91），敏感性为90.48%（19/21），特异性为97.14%（68/70）。

利用dPCR技术来检测血液标本中HER2基因表达状态，结果显示血液标本HER2检测的准确性与组织标本一致性很高，说明通过dPCR检测血液中HER2表达水平是一个非常好的手段，可作为癌症治疗过程中的监测工具。

参考文献：

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