全外显子组测序（WES）已成为医学遗传学诊断的核心工具。然而，市售WES试剂盒在探针设计（如ssRNA vs dsDNA）、靶向区域大小和建库方法上差异显著。过往多数对比研究仅局限于外周血样本，而临床实践中大量遇到的羊水、绒毛膜绒毛（CVS）、干血斑（DBS）、成纤维细胞等非血液样本，因采集条件、提取方法或长期储存导致DNA质量受损，其对不同试剂盒的稳健性提出了更高要求，但缺乏系统性评估。

2026年7月14日，巴塞罗那临床医院（Hospital Clínic de Barcelona）团队在 International Journal of Molecular Sciences 发表了一项对比研究，首次系统评估了三种主流WES试剂盒（Illumina、Agilent、Twist）在多种真实临床组织样本中的表现，Twist Exome 2.0在覆盖均匀性、基因覆盖度和难测区域捕获方面全面领先，尤其在非血液低质量DNA样本中优势*为显著。

研究设计

一、研究对象

研究团队选取了三种在欧洲分子诊断实验室中广泛使用的商业化WES试剂盒：

1. Agilent SureSelect V8 ：80-mer ssRNA探针，靶向区域35.1 Mb；

2. Illumina DNA Prep Exome 2.5：120-mer dsDNA探针，靶向区域37.8 Mb；

3. Twist Exome 2.0 Plus :120-mer dsDNA,靶向区域37.8 Mb；

二、样本组成

研究分两个阶段进行：

• 比较阶段（8样本）：4份外周血 + 4份非外周血（羊水2份、胎儿组织1份、成纤维细胞1份），同时使用三种试剂盒建库测序。

• 验证阶段（24样本）：使用**阶段表现较优的Twist试剂盒，对先前已用Agilent测序过的临床样本进行重测序验证。包含12份外周血 + 12份非外周血（羊水5份、胎儿组织2份、绒毛膜绒毛2份、干血斑3份）。
  

三、分析框架

采用自建Nextflow流程（BWA-MEM比对，Mosdepth/Picard质控）。临床相关区域定义为PanelApp UK数据库451个基因面板覆盖的4100个临床基因。难测区域（DTS）采用Hijikata等定义的795个短读长测序困难区域（涉及175个基因）。

核心结果

一、覆盖均匀性

解读：

8张密度图分别展示了羊水（2份）、胎儿组织、成纤维细胞和外周血（4份）中，三种试剂盒的靶向外显子区域平均覆盖深度的分布。

核心发现：

Twist：在所有样本类型中均呈现*集中的峰。这意味着绝大多数靶向外显子区域的覆盖深度高度一致，既没有大量区域低于38x（避免漏检），也没有大量区域远高于75x（避免浪费测序通量）。

Agilent与Illumina：分布曲线明显更扁平。尤其在非外周血样本中，两者曲线显著向左拖尾，说明外显子区域覆盖深度与诊断阈值有差距。

结论：图1直观证明，Twist在覆盖均匀性上具有结构性优势，且这种优势在DNA质量受损的样本中被急剧放大。

二、临床基因覆盖度

解读：

• 在外周血样本中，三款试剂盒的表现差异基本持平，Twist以92.42%略微领先。

• 但在非血液样本中，Agilent的非血液样本38x覆盖率从91.05%降至72.15%，Illumina从80.74%降至81.66%，Twist仅从92.42%降至88.98%。这意味着：当样本DNA质量因预分析因素受损时，Twist表现出*强的稳健性。

• 在高深度阈值（75x、100x）下，Twist的过度测序程度**，说明其测序通量利用效率**。

三、多维质量指标：雷达图的全景对比

解读（顺时针从顶部开始）：

四、难测区域（DTS）捕获

研究还评估了一个极具挑战性的指标——795个被定义为"短读长测序困难区域"（Difficult-to-Sequence, DTS）的临床相关区域（Hijikata et al., 2025）。

这一结果对临床诊断意义重大——许多致病突变恰好位于这些"难测区域"中，捕获能力的差距直接关系到检出率。

讨论与启示

一、技术原因解析

Illumina与Twist使用相同的120mer dsDNA探针和相同靶区BED文件，性能差异大，说明探针化学修饰、封闭试剂、杂交缓冲液、洗脱条件等“软实力”对*终捕获效果影响深远。

Twist更倾向捕获外显子邻近区域，导致on-target比例略低，但换来了更均匀的全靶区覆盖——这是一种“战略性取舍”，对CNV检出和稀有变异检测更友好。

二、临床适用场景推荐

外周血高质量DNA：三家均可，但Twist能以更低测序数据量达到同等诊断灵敏度，节省测序成本；

产前样本（羊水/绒毛）：推荐Twist，其88.98%的38×覆盖率优于Agilent的72.15%，可避免因覆盖不足导致的假阴性或漏诊；

干血斑、培养细胞、FFPE：Twist的高均匀性和低重复率使其成为**，文献亦支持其在降解样本中的优越性。

三、成本效益

研究团队表示，更换为Twist试剂盒后，每批次可上样更多样本，手工操作时间减少，单样本试剂成本下降，实现了“提质增效降本”三赢。

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